加州大学旧金山分校(UC San Francisco)科学家们在没有使用病毒插入DNA的情况下，对被称为T细胞的人类免疫细胞进行了基因重组，这一成果对研究、医学和工业具有重大意义。研究人员说，希望他们的技术——使用CRISPR基因编辑技术的快速、多才多艺、经济的方法——能在新兴的细胞治疗领域得到广泛应用，加速开发新的、更安全的癌症、自体免疫和其他疾病的治疗方法，包括罕见的遗传性疾病。研究的这种新方法发表《自然》上，它提供了一种强大的分子“剪切粘贴”系统来重写人类T细胞的基因组序列。它依赖于电穿孔，在这个过程中，一个电场作用于细胞，使其细胞膜暂时具有更大的渗透性。
博科园-科学科普：经过一年多的实验，UCSF的研究人员发现，当某些T细胞、DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起，然后暴露在适当的电场中时，T细胞就会吸收这些元素，并将特定的基因序列精确地整合到基因组的一个CRISPR-程序切割位点上。UCSF的Alex Marson博士说：这是一种快速、灵活的方法，可以用来改变、增强和重新编程T细胞，这样我们就能赋予它们我们想要的特异性，即我们想要消灭癌症、识别感染、或抑制自身免疫疾病中出现的过度免疫反应。但与新技术的速度和易用性同样重要的是，创新基因组学研究所生物医学主任马森说：这种方法使把大量的DNA片段插入T细胞成为可能，从而赋予细胞强大的新特性。
人体T淋巴细胞(也叫T细胞)的扫描电子显微照片，来自健康供体的免疫系统。图片：NIAID
马森的实验室使用电穿孔和CRISPR已经取得了一些成功的遗传物质插入T细胞，但直到现在许多许多研究人员试图将长序列DNA放到T细胞导致细胞死亡，导致大多数相信大的DNA序列是T细胞过度有毒。为了展示这种新方法的多功能性和威力，研究人员利用它修复了患有罕见的自身免疫遗传形式的儿童T细胞中的致病基因突变，并创造了定制的T细胞来寻找并杀死人类黑色素瘤细胞。病毒通过将自身的遗传物质通过细胞膜注射而引起感染。自20世纪70年代以来，科学家们利用了这种能力，剥离了病毒的传染性特征，并利用由此产生的“病毒载体”将DNA传输到细胞中进行研究、基因治疗，以及最近一个广为人知的例子，创造出用于癌症免疫治疗的CAR-T细胞。
目前，美国食品和药物管理局已经批准了用病毒设计的T细胞来对抗某些类型的白血病和淋巴瘤。但是，创造病毒载体是一个艰苦、昂贵的过程，而临床级载体的短缺导致了基因疗法和细胞疗法的制造瓶颈。即使有，病毒载体也远非理想，因为它们随意地将基因插入到细胞基因组中，这可能会破坏现有的健康基因，或者使新引入的基因不受调控机制的控制，而调控机制确保细胞正常运行。这些限制，可能导致严重的副作用，已经引起基因治疗和细胞治疗，如汽车免疫治疗的关注。第一作者西奥·罗斯(Theo Roth)说：我们花了30年的时间试图把新基因植入T细胞。
现在不应该再需要有六七个人在实验室里研究病毒来设计T细胞，如果我们开始看到数百个实验室工程这些细胞，而不是只有几个，并且研究越来越复杂的DNA序列，将尝试更多的可能性，这将大大加快下一代细胞疗法的发展。经过近一年的反复试验，罗斯确定了T细胞数量、DNA数量和CRISPR丰度的比值，再加上适当的参数提供的电场，将使T细胞基因组得到高效、准确的编辑。为了验证这些发现，罗斯指导CRISPR用绿色荧光蛋白(GFP)标记一组不同的T细胞蛋白，结果是高度特异性的，“非靶向”效应的水平非常低:每个亚细胞结构的Roth的CRISPR模板都被设计成用GFP标记，而在显微镜下没有其他的绿色标记。
然后，在为新技术的治疗承诺提供原则的补充实验中，Roth、Marson和他的同事们展示了如何利用它来将T细胞聚集起来对抗自身免疫性疾病或癌症。在第一个例子中，罗斯和他的同事们使用了耶鲁医学院凯夫恩·赫罗德博士提供给马森实验室的T细胞。基因组测序显示，这些儿童的T细胞携带一种叫做IL2RA的基因突变。这一基因包含了细胞表面受体的指令，这是调节T细胞(或treg)的必要条件，它能阻止其他免疫细胞检查和防止自身免疫。使用非病毒CRISPR技术，UCSF团队能够快速修复儿童T细胞中的IL2RA缺陷，并恢复因突变而受损的细胞信号。在CAR-T疗法中，从身体中移除的T细胞被设计成增强它们的抗癌能力，然后再回到身体中以肿瘤为目标。研究人员希望类似的方法能够有效治疗treg功能失调的自身免疫性疾病，比如在3个患有IL2RA突变的儿童身上。
在与加州大学洛杉矶分校帕克癌症免疫治疗研究所的Cristina Puig-Saus博士和Antoni Ribas医学博士合作进行的第二组实验中，科学家们用新受体替换了正常人类T细胞群体中的天然T细胞受体，这些受体被特别设计以寻找人类黑色素瘤细胞的一种亚型。T细胞受体是细胞用来检测疾病或感染的传感器，在实验室培养皿中，经过改造的细胞可以有效地定位于靶向的黑色素瘤细胞，同时忽略其他细胞，表现出一种特异性，这是精准抗癌药物的主要目标。在不使用病毒的情况下，研究人员能够产生大量重新编程的crispr - engineering细胞来显示新的T细胞受体。当移植到植入人类黑色素瘤的小鼠体内时，经过改造的人类T细胞进入肿瘤部位，显示出抗癌活性。
UCSF癌症免疫疗法的帕克研究所的成员，也是陈-扎克伯格生物中心的研究员Marson说：这种替换T细胞受体的策略可以推广到任何T细胞受体，有了这项新技术，我们可以剪切和粘贴到特定的地方，重写基因组序列中的特定页面。因为新技术有可能在一周多的时间内创造出可行的定制的T细胞系，因此已经在Marson实验室中改变了研究环境。以前认为由于病毒载体所产生的障碍而被认为太困难或太昂贵的实验的想法已经成熟，可以进行研究了。将研究20个‘疯狂’的想法，因为我们可以非常迅速地创建CRISPR模板，一旦我们有了一个模板，就可以把它转化成T细胞，并迅速地将它们成长起来。
马森将这种新方法的成功归功于罗思的“绝对坚持”，因为人们普遍认为病毒载体是必要的，T细胞只能容忍一小段DNA。西奥确信，如果能找到合适的条件，就能克服这些被感知到的限制，他付出了巨大的努力来测试数千种不同的条件：CRISPR与DNA的比率，培养细胞的不同方法，不同的电流。通过优化每一个参数并把最好的条件放在一起，能够看到这个惊人的结果。
博科园-科学科普｜参考期刊：Nature｜研究/来自：加州大学旧金山分校
博科园-传递宇宙科学之美
